應(yīng)激是導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生的重要原因之一。通常，誘發(fā)人類(lèi)抑郁癥的生理心理發(fā)生變化應(yīng)激源屬于社會(huì)性應(yīng)激[1]。研究表明，長(zhǎng)時(shí)間的慢性應(yīng)激刺激后，動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)一系列的抑郁樣癥狀包括社會(huì)回避行為、快感缺失、行為絕望等，且抗抑郁藥物能逆轉(zhuǎn)這些改變。本實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果表明，在造模7天后動(dòng)物出現(xiàn)明顯的社會(huì)回避行為，造模14天模型組出現(xiàn)對(duì)焦慮沖突行為，造模21天后動(dòng)物出現(xiàn)明顯的行為絕望并表現(xiàn)出快感缺失癥狀，造模28天后動(dòng)物快感缺失癥狀及其顯著。造模28天后，在社會(huì)交互實(shí)驗(yàn)、糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)、新奇抑制攝食實(shí)驗(yàn)、懸尾和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出持續(xù)、穩(wěn)定、最明顯的抑郁樣行為改變，因此建議選擇CSDS造模28天進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)為宜。

目前，抑郁癥的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。單胺神經(jīng)遞質(zhì)假說(shuō)是抑郁癥發(fā)病機(jī)制中最重要的假說(shuō)之一[2]。該假說(shuō)認(rèn)為抑郁癥是由于大腦某些區(qū)域單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平異常引起的。臨床上應(yīng)用的大多數(shù)一線(xiàn)抗抑郁藥，如三環(huán)類(lèi)抗抑郁藥( TCAs) 、5-羥色胺重?cái)z取抑制劑（SSRI）等，也正是通過(guò)抑制突觸前膜單胺類(lèi)遞質(zhì)再攝取，升高突觸間隙單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平而發(fā)揮抗抑郁作用[3]。本實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示CSDS抑郁模型動(dòng)物海馬和皮層中5-HT、NE和DA含量顯著降低，表明CSDS抑郁模型的發(fā)生機(jī)制與單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)。

下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸是一個(gè)重要的內(nèi)分泌軸參與與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展。研究表明，慢性應(yīng)激會(huì)激活并損傷HPA軸功能從而誘發(fā)抑郁癥，下丘腦分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子，調(diào)節(jié)腺垂體分泌促腎上腺皮質(zhì)激素，最終引起CORT分泌過(guò)量，進(jìn)而引起機(jī)體損傷[4]。臨床研究表明，抑郁癥患者血漿和腦脊液CORT含量顯著升高[5, 6]。本研究發(fā)現(xiàn)，CSDS模型小鼠血清CORT較正常組明顯升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

海馬神經(jīng)發(fā)生是指神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化遷移整合入神經(jīng)回路中生成具有功能的神經(jīng)元，整合進(jìn)入原有海馬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)可影響海馬的功能，在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[7-9]。DCX( doublecortin，微管結(jié)合蛋白)，是神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志蛋白，常常用來(lái)反映神經(jīng)發(fā)生。成人大腦中，DCX+細(xì)胞表達(dá)局限于神經(jīng)發(fā)生的兩個(gè)腦區(qū)和新生未成熟神經(jīng)元的遷移區(qū)，因此可以用來(lái)研究新生神經(jīng)元的分化、遷移，是比較常用的研究神經(jīng)發(fā)生的標(biāo)志蛋白[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CSDS模型組小鼠NueN + DCX標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞明顯降低，表明模型組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元增生受到抑制，提示CSDS能抑制了海馬神經(jīng)再生與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

研究表明抑郁癥患者和抑郁癥模型動(dòng)物海馬中的BDNF表達(dá)水平下調(diào) [11]。而多種抗抑郁藥物（如五羥色胺再攝取抑制劑及三環(huán)類(lèi)抗抑郁藥物）均能逆轉(zhuǎn)BDNF表達(dá)的降低同時(shí)明顯改善神經(jīng)元損傷[12, 13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比CSDS模型組小鼠海馬的BDNF表達(dá)水平顯著降低。此外，本實(shí)驗(yàn)中CSDS模型小鼠海馬組織中BDNF信號(hào)通路相關(guān)蛋白CREB、ERK1/2的磷酸化水平較對(duì)照組明顯降低，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果也是一致的。

綜上所述，慢性社會(huì)挫敗28天能后模型小鼠出現(xiàn)快感缺失，社會(huì)回避、行為絕望等抑郁樣行為，且其血清皮質(zhì)酮水平和海馬和前額皮層5-HT、NE、DA 水平顯著降低；海馬神經(jīng)發(fā)生抑制； BDNF及的表達(dá)及下游pCREB, p-AKT,和p-CREB的表達(dá)水平明顯減少。本研究結(jié)果顯示社會(huì)挫敗應(yīng)激28天建立了穩(wěn)定小鼠抑郁癥動(dòng)物模型，且模型表現(xiàn)出良好的表觀、結(jié)構(gòu)及預(yù)測(cè)效度。

不同于其他物理應(yīng)激模型， CSDS是以動(dòng)物間的從屬關(guān)系為基礎(chǔ)的社會(huì)應(yīng)激方式，是一種心理應(yīng)激模型。它通過(guò)同種動(dòng)物相同或不同品系個(gè)體間的個(gè)體斗爭(zhēng)后，引起挫敗動(dòng)物產(chǎn)生情緒和心理壓力，從而導(dǎo)致其產(chǎn)生抑郁行為，可以很好的模擬人類(lèi)在生活中遭受社會(huì)心理壓力所致的抑郁癥。CSDS具有良好的建構(gòu)效度、表面效度和預(yù)測(cè)效度，對(duì)于抑郁癥的病理生理研究和抗抑郁藥物篩選有重要意義。

技術(shù)難點(diǎn)：慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激時(shí)動(dòng)物可能在造模過(guò)程中產(chǎn)生物理性傷害，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建議在物理傷口大于一厘米是將該動(dòng)物進(jìn)行安樂(lè)處死。并篩選合適的攻擊CD-1 小鼠。

參考文獻(xiàn)：

[1] 彭云麗,王雯英,蔣春雷,王云霞.應(yīng)激誘發(fā)抑郁癥的細(xì)胞因子機(jī)制研究進(jìn)展[J].生理學(xué)報(bào),2013,65(02):229-236

[2] López-Mu?oz F, Alamo C. MonoaminergicNeurotransmission: The History of the Discovery of Antidepressants from 1950sUntil Today[J]. Current Pharmaceutical Design, 2009, 15(14):1563-1586.

[3]Fournier J C, Derubeis R J,Hollon S D, et al. Antidepressant Drug Effects and Depression Severity: APatient-Level Meta-Analysis[J]. Journal of the American Medical Association,2010, 303(1):47-53.

[4] 柴麗,趙博.抑郁癥與HPA軸關(guān)系及中藥干預(yù)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(12):268-271.

[5]Yang X H, Song S Q, Xu Y.Resveratrol ameliorates chronic unpredictable mild stress-induceddepression-like behavior: involvement of the HPA axis, inflammatory markers,BDNF, and Wnt/β-catenin pathway in rats[J]. Neuropsychiatric Disease andTreatment, 2017, 13:2727-2736.

[6]Gu L, Liu Y J, Wang Y B, et al.Role for monoaminergic systems in the antidepressant-like effect of ethanolextracts from Hemerocallis citrina[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2012,139(3):780–787.

[7]Abehiguchi N, Uchida S,Yamagata H, et al. Hippocampal Sirtuin 1 Signaling Mediates Depression-likeBehavior[J]. Biological Psychiatry, 2016, 80(11):815-826.

[8]Sahay A, Hen R. Adulthippocampal neurogenesis in depression[J]. Nature Neuroscience, 2007,10(9):1110-1115.

[9]Park S C. Neurogenesis andantidepressant action[J]. Cell & Tissue Research, 2019, 377(1):95-106.

[10] Couillard-Despres S, Winner B,Schaubeck S, et al. Doublecortin expression in adult brain reflectneurogenesis[J]. European Journal of Neuroscience, 2005, 21(1):1-14.

[11] Deyama S , Bang E , Kato T , etal. Neurotrophic and Antidepressant Actions of Brain-Derived NeurotrophicFactor Require Vascular Endothelial Growth Factor[J]. Biological Psychiatry,2019, 86(2):143-152.

[12] Duman R S, Aghajanian G K,Sanacora G, et al. Synaptic plasticity and depression: new insights from stressand rapid-acting antidepressants[J]. Nature Medicine, 2016, 22(3):238-249.

[13] Mostert J P, Koch M W, HeeringsM, et al. Therapeutic Potential of Fluoxetine in Neurological Disorders[J]. CNSNeuroscience & Therapeutics, 2008, 14(2):153-164.

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)范，對(duì)環(huán)境和生態(tài)影響等符合國(guó)家相關(guān)法律規(guī)定。

1材料

（1)試劑：

鹽酸氟西汀片，批號(hào)：20190516，常州四藥制藥有限公司。

乙腈（色譜純），美國(guó)Merck 公司；

甲醇（色譜純），美國(guó)Merck 公司；

甲酸銨（分析純），北京化工廠；

去甲腎上腺素（NE）標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所；

5-羥色胺（5-HT）標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma 公司；

多巴胺（DA）標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma 公司；

3,4-二羥基芐胺（DHBA）內(nèi)標(biāo)，美國(guó)Sigma 公司；

異丙醇（分析純） 北京化學(xué)試劑公司

無(wú)水乙醇（分析純） 北京化學(xué)試劑公司

氯仿（分析純） 北京化學(xué)試劑公司

甲醛（分析純） 北京化學(xué)試劑公司

無(wú)水乙醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

二甲苯，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

甲苯胺藍(lán)染色試劑，武漢谷歌生物科技有限公司

中性樹(shù)膠，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

EDTA抗原修復(fù)液, 武漢賽維爾生物科技有限公司

檸檬酸 抗原修復(fù)液, 武漢賽維爾生物科技有限公司

Doublecortin antibody (Ab77450)，英國(guó)Abcam公司

Anti-NeuN antibody (Ab177487), 英國(guó)Abcam公司

Fluorescein isothiocyanate-labelled horseanti-rabbit IgG, 美國(guó)Pierce公司

Rhodamine-labelled goat anti-mouse IgG, 美國(guó)Pierce公司

PBS緩沖液, 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司

Tween-20，美國(guó)Amresco公司

Protein Ladder, 賽默飛

BDNF antibody (Ab108319)，英國(guó)Abcam公司

Doublecortin antibody (Ab77450)，英國(guó)Abcam公司

Anti-NeuN antibody (Ab177487), 英國(guó)Abcam公司

CREB antibody (#9197), 美國(guó)Cell Signaling Technology (CST)公司

Phospho-CREB antibody (#9198), 美國(guó)Cell Signaling Technology (CST)公司

p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody (#9107), 美國(guó)Cell Signaling Technology (CST)公司

Phospho- p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody (#4370), 美國(guó)Cell Signaling Technology (CST)公司

β-ACTIN antibody (#4967), 美國(guó)CellSignaling Technology (CST)公司

HRP-linked goat anti rabbit IgG antibody (#7074), 美國(guó)Cell Signaling Technology (CST)公司

HRP-linked goat anti mouse IgG antibody (#7076), 美國(guó)Cell Signaling Technology (CST)公司

總蛋白定量測(cè)定試劑盒（BCA法）, 南京建成生物工程研究所

小鼠血清皮質(zhì)酮（CORT）試劑盒，中國(guó)南京建成生物工程研究所

（2）儀器：

Milli-Q超純水儀，美國(guó)Millipore公司

AL104電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司

1200型液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)Agilent公司

Q-Trap5500型質(zhì)譜分析儀，美國(guó)應(yīng)用生物技術(shù)公司

Infinite M1000全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司

2720型PCR儀 美國(guó)ABI公司

system electrophoresis Mupid（Mupid 2plus）電泳槽 日本TAKARA公司

image system(EUV-LDUV)凝膠成像系統(tǒng) 韓國(guó)KoreaBiotech公司

centrifuge（MICRO 17TR）離心機(jī) 韓國(guó)Hanil公司

超凈工作臺(tái) 蘇州凈化公司

2.5μl/10μl/100μl/200μl/1000μl移液器 德國(guó)Eppendorf公司

Eppendorf epMotion 5070 自動(dòng)加樣項(xiàng)目合作單位 德國(guó)Eppendorf公司

autoclave（LS-B50L）滅菌器 中國(guó)江陰濱江公司

Freezer Big（DW-40L262）冰箱 青島海爾公司

mixer vortex（Voltex-Genie2 ）漩渦混合器 美國(guó)SI公司

脫水機(jī)，武漢俊杰電子有限公司

包埋機(jī)，武漢俊杰電子有限公司

病理切片機(jī)，上海徠卡儀器有限公司

凍臺(tái)，武漢俊杰電子有限公司

組織攤片機(jī)，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司

烤箱，上海慧泰儀器制造有限公司

載玻片及蓋玻片，江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司

正置光學(xué)顯微鏡，日本尼康

成像系統(tǒng)，日本尼康

2 評(píng)價(jià)方法

2.1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1) 社會(huì)交互實(shí)驗(yàn)

在最后一次社會(huì)挫敗應(yīng)激刺激的24h內(nèi)進(jìn)行社會(huì)交互實(shí)驗(yàn)[28]。社會(huì)交互實(shí)驗(yàn)設(shè)備包括方形白色亞克力塑料測(cè)試箱 (40×40×40cm), 穿孔透明亞克力塑料盒（7×10×40 cm）及錄像設(shè)備。實(shí)驗(yàn)前將透明塑膠盒置于測(cè)試箱一側(cè)中央位置。社會(huì)交互實(shí)驗(yàn)包括兩個(gè)階段分別為沒(méi)有交互對(duì)象的適應(yīng)期和有交互對(duì)象的檢測(cè)期，每個(gè)階段150s，兩個(gè)階段間隔30s內(nèi)。在適應(yīng)期內(nèi)，將每只測(cè)試的C57小鼠背向塑料盒輕輕放入測(cè)試箱中央，開(kāi)始第一階段的檢測(cè)，允許其自由探索150 s。適應(yīng)期結(jié)束后立即把檢測(cè)小鼠從測(cè)試箱中拿出，放回其原來(lái)的飼養(yǎng)籠中。然后將一只攻擊鼠放入透明塑料盒里，接著將測(cè)試鼠再次背對(duì)塑料盒重新放入測(cè)試箱中央，開(kāi)始第二階段，并允許它再次探索150秒。攝像機(jī)記錄了C57BL/6小鼠在適應(yīng)期和檢測(cè)期間在交互區(qū)（定義為塑料盒周?chē)鷮?cm的U形區(qū)域）停留的時(shí)間。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用75%消毒酒精擦拭測(cè)試箱和塑料盒，避免氣味對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。

2) 糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)

糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)分為訓(xùn)練期及測(cè)試期[29]。訓(xùn)練期共兩天，所有動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，給予每只小鼠兩瓶液體：一瓶蔗糖糖水 (1%) +一瓶純水，訓(xùn)練期期間動(dòng)物自由飲食飲水，期間每個(gè)12小時(shí)更換水瓶位置，保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境安靜。訓(xùn)練期次日9:00 am，將食物和水瓶取出，動(dòng)物禁食（不禁水）共8 h。下午17:00 pm，進(jìn)行糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)測(cè)試，每只小鼠自由飲用提前稱(chēng)好重量的糖水和純水共16h。次日早上9:00 am，取下糖水瓶和純水瓶稱(chēng)重。根據(jù)動(dòng)物糖水、純水?dāng)z入量計(jì)算動(dòng)物的糖水偏愛(ài)指數(shù)（糖水偏愛(ài)指數(shù) = 糖水消耗/總液體消耗 × 100%）。測(cè)試結(jié)束后，加食加水，所有動(dòng)物自由飲食飲水。

3) 新奇攝食抑制實(shí)驗(yàn)

在動(dòng)物禁食(不禁水)24h后進(jìn)行新奇抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)[30]，檢測(cè)前預(yù)先在測(cè)試箱（方形、黑色）中心放入一顆飼料（保證每次實(shí)驗(yàn)每顆飼料大小相等），然后將小鼠背對(duì)飼料放入測(cè)試箱的一角即開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，時(shí)間檢測(cè)時(shí)間為5min。保證每次從同一方向?qū)?dòng)物放入同一位置。觀察記錄動(dòng)物自放入籠中至首次攝取食物的時(shí)間(即攝食潛伏期)，以動(dòng)物開(kāi)始咬食飼料為攝食標(biāo)準(zhǔn)。

4) 小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)

將小鼠尾巴距尾尖部約1cm 處纏上膠布，通過(guò)與S性小鐵鉤與懸尾箱支架上的傳感器相連,小鼠呈倒懸體位, 其頭部離懸尾箱底面約5cm。總的懸掛時(shí)間為6min, 統(tǒng)計(jì)小鼠后4min內(nèi)懸尾累積不動(dòng)時(shí)間（不動(dòng)狀態(tài)即小鼠停止掙扎不動(dòng)或無(wú)任何活動(dòng)）。

5) 小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

將小鼠分別放入水深15cm的小鼠恒溫游泳儀（高20cm，直徑14cm）中，水溫維持在24±1℃。測(cè)試總共6min, 前2min適應(yīng)期結(jié)束后，計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄小鼠后4min內(nèi)游泳累積不動(dòng)時(shí)間。

2.2 血清皮質(zhì)酮水平的測(cè)定

以生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定小鼠血清中皮質(zhì)酮（CORT）含量，按照試劑盒的操作步驟進(jìn)行，于450nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度（OD）值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其含量單位分別是：pg/mL，ng/L，ng/mL

2.3 小鼠模型單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響

2.3.1 腦組織樣品處理

UFLC-MS/MS檢測(cè)前從-80℃冰箱中取出冰凍的海馬組織，稱(chēng)重，并記錄質(zhì)量，加入100 μL的超純水，冰浴中超聲勻漿得海馬勻漿液。精密吸取50 μL組織勻漿液，加入100 μL 4℃乙腈（含內(nèi)標(biāo)DHBA 5 μg/mL），渦旋混勻后置于-80℃冰箱過(guò)夜。次日取出勻漿液于4℃低溫離心（2×104 rpm，30 min），取上清液轉(zhuǎn)入樣品瓶中進(jìn)行神經(jīng)遞質(zhì)濃度分析。

2.3.2 色譜條件

檢測(cè)采用TSK Gel amide 80（2.0mm×150mm，3μm）色譜柱,柱溫35℃，流動(dòng)相為乙腈-15mM甲酸銨水溶液（pH 5.5）（40:60）,流速0.4 mL/min。

2.3.3 質(zhì)譜條件

檢測(cè)采用美國(guó)應(yīng)用生物技術(shù)公司（AB SCIEX）的Q-Trap 5500型質(zhì)譜分析儀，以電噴霧電離方式進(jìn)行離子化，以多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）模式進(jìn)行掃描，離子源及其他相關(guān)參數(shù)優(yōu)化為：TEM: 500 oC； CAD: Medium； Gas1: 50 psi； Gas2: 70 psi； CUR: 20 psi。

+MRM模式參數(shù)為：噴霧電壓5500 V; EP: 10; CXP: 10;

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)液的配制精密稱(chēng)定5-HT、DA和NE的標(biāo)準(zhǔn)品各2 mg裝入試管中，分別加入80%甲醇（含0.2%甲酸）配制成1 mg/mL的儲(chǔ)備液，放于-80℃冰箱備用。精密稱(chēng)取DHBA 2mg，用80%甲醇（含0.2%甲酸）配制成1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)（IS）儲(chǔ)備液，存于-80℃冰箱備用。實(shí)驗(yàn)前，取各儲(chǔ)備液適量，混勻后，以80%甲醇（含0.2%甲酸）稀釋成系列混合標(biāo)準(zhǔn)液，其中5-HT、DA、E、NE和DOPAC的濃度分別為200，100，1，0.2 ng/ml。2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)檢測(cè)前，吸取各混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液各50 μL，加入含內(nèi)標(biāo)DHBA （5 μg/mL）的乙腈溶液100 μL，渦旋混勻，然后精密吸取5 μL溶液裝入進(jìn)樣小瓶（含內(nèi)襯）放入U(xiǎn)FLC-MS/MS進(jìn)行分析。分別以各神經(jīng)遞質(zhì)的濃度作為橫坐標(biāo)，質(zhì)峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值作為縱坐標(biāo)，通過(guò)軟件進(jìn)行線(xiàn)性回歸，最后繪制出對(duì)應(yīng)的神經(jīng)遞質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。2.4 SY對(duì)CSDS小鼠模型海馬海馬神經(jīng)發(fā)生的影響免疫熒光（Neun+DCX）（1）石蠟包埋切片：將大鼠腦片進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，把切好的腦片置于載玻片上。（2）脫蠟：a.脫蠟：二甲苯或松節(jié)油(Ⅰ)作用5～15min→二甲苯或松節(jié)油（Ⅱ）作用5～10min。b.清洗：無(wú)水乙醇處理1～2min→95%乙醇處理1～2min→80%乙醇處理1～2min→70%乙醇處理1～2min→水洗、蒸餾水洗0.5～2min。（3）抗原修復(fù)：EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）倒進(jìn)修復(fù)盒中裝滿(mǎn)后將組織切片小心浸入修復(fù)緩沖液中，然后放入微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)15分鐘（中火加熱7～8min→停止加熱7～10min→中低火加熱7～8min，需保證組織切片不能太干。取出組織切片，自然冷卻后用PBS（PH7.4）清洗3次，每次5min。（4）畫(huà)圈自發(fā)熒光淬滅：組化筆在腦組織周?chē)?huà)圈，然后在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑（5min～7min），水洗、用流水沖洗（8min～10min）。（5）封閉:在圈內(nèi)滴加40uL的BSA，室溫條件下，孵育（25min～30min）。（6）抗體反應(yīng)：小心的在腦切片上滴加一定量的一抗（預(yù)先用PBS按一定比例配好）。然后將加好一抗的腦切片平放在濕盒內(nèi)，放入4°C冰箱中過(guò)夜。第二天將玻片從冰箱中取出，吸出一抗后將組織切片放入PBS中洗滌3次，每次5min～10min。小心的再圈內(nèi)滴加二抗使其覆蓋組織，然后室溫條件下孵育50min，此過(guò)程應(yīng)在避光條件下進(jìn)行。（7）DAPI復(fù)染細(xì)胞核：組織切片置于PBS洗滌3次，每次5min。在圈內(nèi)滴加DAPI染液，室溫條件下，孵育10min，此過(guò)程應(yīng)在避光條件下進(jìn)行。（8）封片：再次用 PBS洗組織切片（每次5min～10min，洗3次）加入抗熒光淬滅封片劑封片。（9）拍照、觀察。2.5 SY對(duì)CSDS小鼠模型BDNF信號(hào)通路的影響2.5.1 蛋白抽提預(yù)冷RIPA蛋白抽提試劑，加入蛋白酶抑制劑（cocktail）；12000rpm（4度）離心15min。取上清，進(jìn)行蛋白定量。2.5.2 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定（BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒）按照試劑盒使用說(shuō)明操作，測(cè)定蛋白濃度。1. 按照50:1比例配制BCA工作液。2. 完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為2mg/ml。3. 加入按照不同濃度的的標(biāo)準(zhǔn)品至20μl。4. 加入等體積配置好的樣本。5. 每個(gè)檢測(cè)孔分別加入200μl的50:1比例配制而成的工作液，設(shè)置溫度37℃，放置30分鐘。6. 將酶標(biāo)儀調(diào)整到562 nm波長(zhǎng)處，然后測(cè)OD值。7. 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出蛋白濃度。4.1.6.3 WB實(shí)驗(yàn)（一）SDS-PAGE電泳1. 配備10％分離凝膠，加入TEMED膠灌膠，并用異丙醇密封。2. 等至膠凝充分凝固后倒去膠上層異丙醇，吸干（吸水紙）。3. 配制濃縮膠（4.8％）后灌膠（加入 TEMED），在上層空間灌入濃縮膠使用梳子插入濃縮膠中。4. 計(jì)算樣本品所需量，并與5×loading buffer充分混勻，沸水煮5min后立即速冷。5. 根據(jù)蛋白定量的結(jié)果，第1孔加入marker蛋白，其它每孔加入20 ul已變性蛋白，進(jìn)行電泳。在電壓80 V下進(jìn)行濃縮膠電泳，120V電壓下分離膠電泳。當(dāng)?shù)鞍譵arker條帶分開(kāi)清晰時(shí)即終止。（二）轉(zhuǎn)膜1. 根據(jù)蛋白marker指示，分別切膠，CREB，P-CREB，AKT（70-75 KD），pAKT，ERK1/2，P- ERK1/2,β-actin。2. 將NC膜浸濕后與濾紙共同放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸透。3. 將濾紙，膜，膠按照順序放好（未觀察到氣泡）。4. 蓋上儀器，接通電源，轉(zhuǎn)膜300 mA，AKT、pAKT約2 h，CREB、P-CREB、β-actin 約1 h。5. 轉(zhuǎn)膜后，將膜取出放入TBST中清洗5 min。6. 使用麗春紅染膜測(cè)轉(zhuǎn)膜效率。（三）封閉配制5%脫脂奶粉，將轉(zhuǎn)膜浸入脫脂奶粉后靜置1.5h。（四）一抗孵育按照說(shuō)明將一抗按比例稀釋?zhuān)豢狗跤蠓湃氡湔{(diào)溫度至4度過(guò)夜。

（五）二抗孵育次日，洗膜三次后，用TBST稀釋HRP標(biāo)記的二抗，其中小鼠抗（M）和兔抗（R）稀釋液為1： 5000和1：6000， 稀釋后，將第二抗體與膜一起溫育90分鐘。（六）顯色/曝光采用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)（ECL、SuperSignal）采用檢測(cè)法，首先將ECL化學(xué)發(fā)光液與膜共同孵育3分鐘，在吸盡液體后用保鮮膜將膜包裹雜交膜，最后再暗盒內(nèi)曝

光15 min顯影沖洗。Western blot結(jié)果以AKT、pAKT、CREB、pCREB與β-action條帶灰度值的相對(duì)比值記錄。3 評(píng)價(jià)結(jié)果① 慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激對(duì)小鼠行為學(xué)的影響 實(shí)驗(yàn)中，社會(huì)交互實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CSDS造模7天、14天、21天和28天后模型小鼠在交互區(qū)的時(shí)間與正常對(duì)照組相比顯著減少，動(dòng)物表現(xiàn)出明顯的社會(huì)回避行為；而陽(yáng)性藥氟西汀給藥14天、21天和28天可以逆轉(zhuǎn)CSDS引起的社會(huì)回避行為。提示CSDS造模7天后動(dòng)物出現(xiàn)明顯的社會(huì)回避行為，氟西汀給藥14天后可改善其社會(huì)回避行為。在糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)中，與空白組相比，CSDS造模7天和14天動(dòng)物的糖水消耗量并沒(méi)有明顯改變，在造模21天和28天時(shí)，模型組動(dòng)物的糖水偏愛(ài)指

數(shù)為較正常組相比顯著降低；與模型組相比，陽(yáng)性藥氟西汀給藥21天后可以顯著增加動(dòng)物糖水偏愛(ài)指數(shù)，給藥28天極顯著增加動(dòng)物的糖水偏愛(ài)指數(shù)。提示，CSDS造模21天和28天可引起動(dòng)物的快感缺失的抑郁樣癥狀，且氟西汀給藥可逆轉(zhuǎn)這一抑郁樣行為。新奇攝食抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，CSDS造模14天、21天和28天后，挫敗小鼠攝食潛伏期顯著增加；與模型組相比，陽(yáng)性藥氟西汀給藥21天和28天可以顯著減少CSDS引起的攝食潛伏期的增加。提示CSDS造模14天后動(dòng)物表現(xiàn)出明顯的沖突矛盾的抑郁焦慮樣行為，而氟西汀給藥21天后可改善這種抑郁焦慮行為。懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，CSDS造模21天后，挫敗小鼠在TST和FST中，其均不動(dòng)時(shí)間顯著增加，CSDS造模21天后，模型小鼠在TST和FST中，其不動(dòng)時(shí)間極顯著增加；與模型組相比，陽(yáng)性藥氟西汀給藥21天和28天可以顯著逆轉(zhuǎn)CSDS引起小鼠在TST和FST不動(dòng)時(shí)間的改變。提示CSDS造模21天和28天動(dòng)物表現(xiàn)出明顯的抑郁樣癥狀-行為絕望，而氟西汀給藥

21天和28天可改善這種抑郁樣表現(xiàn)。

4.2.2 慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激28天對(duì)小鼠血清皮質(zhì)酮水平的影響

② 慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激28天對(duì)小鼠腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)和的影響

③ 慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激28天對(duì)小鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的影響

④ 慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激28天對(duì)小鼠海馬區(qū)BDNF-ERK -CREB信號(hào)通路的影響

（1）動(dòng)物：SPF級(jí)C57BL/6J小鼠（20~22g），雄性，6-8周齡；SPF級(jí)CD1小鼠（35~40g），雄性6-8月齡

（2）材料：定制的透明亞克力隔板

（3）儀器：小鼠恒溫游泳儀（KSQT6），小鼠懸尾儀（KSXS01）(均由北京鑫海華儀公司、中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所聯(lián)合研制)

（4）模型誘導(dǎo)方法：

① 篩選CD-1作為攻擊鼠

在社會(huì)挫敗應(yīng)激之前，對(duì)雄性120退役CD-1小鼠(18-20周齡)的攻擊行為進(jìn)行篩選以確保入侵小鼠的受打擊力度。評(píng)價(jià)CD-1小鼠的攻擊行為有兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn): 每只CD1小鼠連續(xù)攻擊C57小鼠至少2天，觀察周期為180秒，篩選期為3天;第一次攻擊在60秒以?xún)?nèi)[15]。最終篩選合格的54只CD-1小鼠選擇作為攻擊鼠在實(shí)驗(yàn)前在挫敗籠子中習(xí)慣性喂養(yǎng)兩周。

② 慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激

造模開(kāi)始后每天將C57小鼠作為“入侵者”放入居住有篩選合格的攻擊鼠（CD1小鼠）的飼養(yǎng)籠內(nèi)，允許它們身體接觸5分鐘[26, 27]。在它們接觸的過(guò)程中，C57小鼠會(huì)受到CD1小鼠間歇性的攻擊，表現(xiàn)出躲避、恐懼、順從等行為。5分鐘的身體接觸后，立即使用多孔的透明有機(jī)亞克力板（厚4mm）將二者隔開(kāi)飼養(yǎng)于同一飼養(yǎng)籠內(nèi)共24小時(shí)，在這 24小時(shí)里C57小鼠與CD1小時(shí)無(wú)身體接觸，但可以從視覺(jué)、嗅覺(jué)、聽(tīng)覺(jué)上感知CD1小鼠從而接受對(duì)它的心理刺激。24小時(shí)后，將C57小鼠取出放入住有另一新的攻擊鼠的飼養(yǎng)籠里重復(fù)之前操作，保證每天C57小鼠接受不同的攻擊鼠的應(yīng)激，應(yīng)激持續(xù)28天。正常組C57小鼠使用同樣的飼養(yǎng)籠，與另一C57小鼠成對(duì)飼養(yǎng)，用多孔的透明有機(jī)亞克力板將二者隔開(kāi)，每天更換不同的居住對(duì)象且保證無(wú)身體接觸。在反復(fù)的社會(huì)挫敗應(yīng)激過(guò)程中，若挫敗鼠出現(xiàn)傷口超過(guò)1厘米的情況下，將小鼠從研究中移除并立即安樂(lè)死。本實(shí)驗(yàn)中4周社會(huì)挫敗應(yīng)激造模，之后進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。

抑郁癥是一種慢性、易復(fù)發(fā)的精神情志障礙性疾病，其典型特征表現(xiàn)為消極沉悶、思維遲緩、快感缺乏、無(wú)價(jià)值感及罪惡感，嚴(yán)重者甚至產(chǎn)生自殺的念頭。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，抑郁癥已成為首要致殘?jiān)颍?0多年抑郁癥將成為導(dǎo)致疾病負(fù)擔(dān)的一個(gè)重大因素[1, 2]。目前抑郁癥的治療以藥物治療為主。而對(duì)于抗抑郁藥物的研究涉及到分子水平、組織、器官和整體動(dòng)物等多個(gè)方面，其中動(dòng)物與人類(lèi)在進(jìn)化上的高度保守性，利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在不同層次的行為響應(yīng)特征與人類(lèi)相比具有的相似性，而且可以避免直接以人體為對(duì)象進(jìn)行研究產(chǎn)生的極大風(fēng)險(xiǎn)及受到的倫理學(xué)制約，抑郁動(dòng)物模型已成為抗抑郁藥物研發(fā)的必要手段[3, 4]。

社會(huì)挫敗應(yīng)激模型是一種社會(huì)性心理應(yīng)激的抑郁模型，以動(dòng)物間的從屬關(guān)系為基礎(chǔ)的社會(huì)應(yīng)激方式，是一種心理應(yīng)激模型[5]。它通過(guò)同種動(dòng)物相同或不同品系個(gè)體間的個(gè)體斗爭(zhēng)后，引起挫敗動(dòng)物產(chǎn)生情緒和心理壓力，從而導(dǎo)致其產(chǎn)生抑郁行為，CSDS具有良好的建構(gòu)效度、表面效度和預(yù)測(cè)效度，對(duì)于抑郁癥的病理生理研究和抗抑郁藥物篩選有重要意義[6,7]。研究表明，長(zhǎng)時(shí)間的慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激刺激后，動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)一系列的抑郁樣癥狀包括社會(huì)回避行為、快感缺失、行為絕望等，且抗抑郁藥物能逆轉(zhuǎn)這些改變[8, 9]。采用社會(huì)挫敗應(yīng)激刺激建立更好地模擬人類(lèi)抑郁癥的發(fā)生方式的抑郁動(dòng)物模型很有必要。研究表明，進(jìn)行社會(huì)挫敗應(yīng)激的天數(shù)不同，其導(dǎo)致的癥狀也不相同。現(xiàn)有的造模方法和造模時(shí)間均沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，因此，本研究在前期實(shí)驗(yàn)研究和文獻(xiàn)調(diào)研的基礎(chǔ)上，選用不同造模周期（1天、7天、14天、28天）通過(guò)社會(huì)交互實(shí)驗(yàn)、糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)、新奇抑制攝食實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)評(píng)價(jià)方法，比較不同社會(huì)挫敗造模周期的抑郁行為學(xué)改變，以期為抑郁癥的研究提供標(biāo)準(zhǔn)化、操作性強(qiáng)的慢性社會(huì)挫敗模型模型。同時(shí)，我們選用氟西汀作為陽(yáng)性藥研究了模型的預(yù)測(cè)效度。

參考文獻(xiàn)：

[1]Malhi G S, Mann J J. Depression[J]. Lancet, 2018,392(10161):2299-2312.

[2]Mcdonnell C. The burden of depression[J]. Nature,2014, 515(7526):163.

[3]Ito N, Hirose E, Ishida T, et al. Kososan, aKampo medicine, prevents a social avoidance behavior and attenuatesneuroinflammation in socially defeated mice[J]. Journal of Neuroinflammation,2017, 14(1):98.

[4]Hao Y, Ge H, Sun M, Gao Y. Selecting anAppropriate Animal Model of Depression[J]. International Journal of MolecularSciences. 2019, 20(19):4827.

[5]桂舒佳,田紹文,謝明.社會(huì)挫敗應(yīng)激模型的研究進(jìn)展[J].社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志,2015,13(24):81-83.

[6]Golden S A, Covington H E, Berton O, et al. Astandardized protocol for repeated social defeat stress in mice[J]. NatureProtocols, 2011, 6(8):1183-1191.

[7]Frijtag J C V, Reijmers L G J E, Harst J E V D,et al. Defeat followed by individual housing results in long-term impairedreward- and cognition-related behaviours in rats[J]. Behavioural Brain Research,2000, 117(1):137-146.

[8]Jiang B, Wang F, Yang S, et al. SKF83959 ProducesAntidepressant Effects in a Chronic Social Defeat Stress Model of Depressionthrough BDNF-TrkB Pathway[J]. International Journal of Neuropsychopharmacology,2014, 18(6):pyu096.

[9]Jiang N, Lv J W, Wang H X, et al.Antidepressant-like effects of 20(S)-protopanaxadiol in a mouse model ofchronic social defeat stress and the related mechanisms[J]. Phytotherapyresearch, 2019, 33(10):2726-2736.