目前沒(méi)有確證 有效的陽(yáng)性藥物，本單位用細(xì)胞模型從市售成藥中篩選有效藥物，發(fā)現(xiàn) PHD1（藥品代號(hào)）可以在細(xì)胞水平抑制病毒復(fù)制，隨后用小鼠模型進(jìn)行了藥效學(xué)評(píng)價(jià)。發(fā)現(xiàn)藥物治療感染小鼠后，臨床癥狀得到改善，病毒復(fù)制被顯著抑制，肺組織病理明顯改善，證明該藥物可治療感染小鼠。

所有涉及的病毒實(shí)驗(yàn)操作全部在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所 ABSL 3 實(shí)驗(yàn)室完成，該實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)具備相關(guān)實(shí)驗(yàn)室和福利倫理資質(zhì)。

1. 動(dòng)物模型評(píng)價(jià)方法

本實(shí)驗(yàn)建立的新型冠狀病毒動(dòng)物模型采用監(jiān)測(cè)臨床癥狀、病毒學(xué)和病理學(xué) 等方法進(jìn)行分析和鑒定，確定該動(dòng)物模型成功建立 。

（1）大體觀(guān)察：臨床癥狀觀(guān)察包括動(dòng)物的體重變化一般癥狀觀(guān)察（弓背、豎毛、反應(yīng)度降低等）等。動(dòng)物感染后主要表現(xiàn)為明顯的體重下降，部分動(dòng)物豎毛，沒(méi)有其他明顯的癥狀。與其他傳染病動(dòng)物模型類(lèi)似，體重下降百分比與疾病狀態(tài)正相關(guān)。

（2） 病毒學(xué)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在肺組織中可以檢測(cè)到病毒 RNA 并能分離到活病毒，在組織勻漿中電鏡下可以觀(guān)察到病毒顆粒，證實(shí)從被感染動(dòng)物中可以分離到病毒，分別在感染后第3天和第5天檢測(cè)到肺組織病毒載量，在病因上成功模擬 COVID 19。

（3）病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，被感染動(dòng)物的肺組織出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎呈彌漫性中度間質(zhì)性肺炎改變，可見(jiàn)肺泡隔增寬、炎細(xì)胞浸潤(rùn)，血管周?chē)准?xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)巨噬細(xì)胞及少量蛋白滲出，在間質(zhì)性肺炎和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)方面與臨床一致。

以上三項(xiàng)指標(biāo)模擬了新型冠狀病毒感染肺炎病人的主要指標(biāo) ，證明小鼠模型成立。

2.評(píng)價(jià)指標(biāo)體系

根據(jù)模型的主要表現(xiàn)，該模型用于研究、疫苗和藥物評(píng)價(jià)時(shí)，與模型對(duì)照組相比，主要檢測(cè)干預(yù)組的三類(lèi)指標(biāo)：

（1）體重下降百分比

與模型對(duì)照組相比，觀(guān)察感染小鼠的體重下降百分比改變情況。

（2）肺組織內(nèi)病毒載量

與模型對(duì)照組相比，檢測(cè)感染小鼠第3天和第5天肺組織內(nèi)病毒載量變化情況。

（3）肺組織病理改變

與模型對(duì)照組相比，檢測(cè)感染小鼠間質(zhì)性肺炎的病理學(xué)改變情況。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1臨床表現(xiàn)

hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠感染后一般狀態(tài)尚可，部分小鼠出現(xiàn)豎毛。感染后小鼠體重出現(xiàn)下降，感染 5天時(shí)平均體重下降百分比達(dá)到5%

3.2病毒學(xué)檢測(cè)

（1）病毒分離

感染第3天和第5天從肺組織分離病毒，勻漿接種Vero細(xì)胞，可發(fā)生有明顯的細(xì)胞病變，在電子顯微鏡下觀(guān)察到病毒的特征性結(jié)構(gòu)。而對(duì)照組小鼠沒(méi)有觀(guān)察到任何異常現(xiàn)象。

（2）病毒載量

在小鼠感染后第三天和第五天分別收集主要臟器，用以檢測(cè)病毒在小鼠體內(nèi)的分布情況。 RT PCR 結(jié)果顯示，感染后 hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠，只有在肺臟顯現(xiàn)出病毒明顯存在。 感染3 天后，肺組織中病毒載量可達(dá)到 106.5拷貝/ml 感染 5 天后，肺組織中病毒載量可達(dá)到 105.0拷貝/ml。

（3）病毒抗原檢測(cè)

在小鼠感染后第三天和第五天分別收集主要臟器，用免疫熒光檢查病毒在小鼠體內(nèi)的分布情況，發(fā)現(xiàn)病毒主要分布于肺臟支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞內(nèi) 。

3.3 病理學(xué)檢查

（1）肺部大體病理

與對(duì)照組相比，感染小鼠肺臟大體病理表現(xiàn)為，肺臟表面出現(xiàn)局灶性病變損傷，呈暗紅色。

（2）肺部組織病理

用免疫組化觀(guān)察了肺組織內(nèi)病毒抗原分布，發(fā)現(xiàn)抗原 分布于支氣管上皮細(xì)胞（藍(lán)箭頭）、肺泡上皮細(xì)胞（黑箭頭）和巨噬細(xì)胞（紅箭頭）。

小鼠感染后肺組織呈彌漫性中度間質(zhì)性肺炎改變，可見(jiàn)肺泡隔增寬、炎細(xì)胞浸潤(rùn)，血管周?chē)准?xì)胞浸潤(rùn)（黑色箭頭），肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)巨噬細(xì)胞（藍(lán)色箭頭）及少量蛋白（綠色箭頭）滲出

3.4抗體檢測(cè)

感染小鼠第14天分離血清，檢測(cè)到特異性IgG產(chǎn)生。

1試驗(yàn)材料

1.1 病毒株

SARS-CoV-2（原2019-nCoV, HB-01），由中國(guó)疾控中心譚文杰教授提供，新型冠狀病毒的全基因組序列可以在GISAID (BetaCoV / Wuhan /IVDC-HB-01 /2020|EPI_ISL_402119)獲得，存放于中國(guó)微生物數(shù)據(jù)中心（登錄號(hào)NMDC10013001，基因組登錄號(hào)MDC60013002-01）。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇SPF 級(jí)6 周至 11月齡各段的ICR 與 C57 BL/ 6J，18-22 g，來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所（IACUC 批準(zhǔn)號(hào)：BLL20001）

2試驗(yàn)操作規(guī)程

2.1 人 hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠的制備

表達(dá)人 hACE2 基因的小鼠，由小鼠ACE2 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，經(jīng) RT-PCR 和 Western blot 驗(yàn)證 hACE2 基因在小鼠肺組織內(nèi)的表達(dá)（圖3）[4]。

2.2 病毒傳代

將新型冠狀病毒接種到Vero細(xì)胞進(jìn)行分離和儲(chǔ)存。Vero細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM（英濰捷基, 美國(guó)）添加10%胎牛血清，100 IU/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中，環(huán)境為37°C，5%CO2。新型冠狀病毒的病毒滴度用標(biāo)準(zhǔn)的半數(shù)細(xì)胞感染率（a standard 50% tissue culture infection dose，TCID50）進(jìn)行分析。

2.3 動(dòng)物模型的感染方法

（1） 途徑：滴鼻；

（2） 感染劑量：1× 105 TCID50 只；

（3） 感染體積：50 μl 只；

（4） 對(duì)照組：等體積 PBS。

2.4 動(dòng)物模型分析

（1）癥狀觀(guān)察：感染后，每天觀(guān)察動(dòng)物一般癥狀，記錄體重。

（2）病毒載量：定時(shí)收集各組動(dòng)物臟器，進(jìn)行RNA抽提，利用RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)組織中病毒載量。RT-PCR所用的新型冠狀病毒引物如下：上游為5’-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3’ 下游為5’-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’。

（3）病毒分離：肺組織在 DMEM 溶液中研磨制備成勻漿，離心分離上清后，接種于Vero細(xì)胞分離病毒并觀(guān)察細(xì)胞病變。

（4）病理學(xué)觀(guān)察 用新鮮的組織制備冰凍切片，將組織固定在冷凍劑上，肺臟組織（10um）切好后在 100% 丙酮內(nèi)固定 15 分鐘，之后用 HE染色，鏡下觀(guān)察。

（5）免疫熒光染色肺臟切片用PBS洗三遍，用固定液充分固定，用封閉液室溫封閉 1h，一抗4°C 封閉過(guò)夜，PBS洗三遍，二抗37°C 孵育1 小時(shí)， PBS 洗三遍。用 DAPI 染細(xì)胞核觀(guān)察新型冠狀病毒在小鼠肺臟上的定位。新型冠狀病毒一抗為病人恢復(fù)期血清，羊源抗人二抗用， FITC 標(biāo)記。

（6）感染后第14天，分離血清，測(cè)定特異性IgG。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理方法

所有的數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6.0 軟件分析，感染組小鼠和其他對(duì)照組小鼠用T 檢驗(yàn)方法分析差異，顯著性差異用*p ﹤ 0.05, **p﹤0.01 或者 #p﹤0.05, ##p﹤0.01 表示。

新型冠狀病毒肺炎起病以發(fā)熱為主要的臨床表現(xiàn)，可合并輕度干咳、乏力、呼吸不暢、腹瀉等癥狀，流涕、咳痰等，咯痰癥狀少見(jiàn)。一半患者在一周后出現(xiàn)呼吸困難，嚴(yán)重者快速進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和出凝血功能障礙。部分患者起病癥狀輕微，可無(wú)發(fā)熱等臨床癥狀，多在1周后恢復(fù)。多數(shù)患者預(yù)后良好，少數(shù)患者病情危重，甚至死亡。

從影像學(xué)表現(xiàn)來(lái)看，早期呈現(xiàn)多發(fā)小斑片影及間質(zhì)改變，以肺外帶明顯。進(jìn)而發(fā)展為雙肺多發(fā)磨玻璃影、浸潤(rùn)影，嚴(yán)重者可出現(xiàn)肺實(shí)變，胸腔積液少見(jiàn)。

從免疫學(xué)表現(xiàn)來(lái)看，患者還可出現(xiàn)發(fā)病早期外周血白細(xì)胞總數(shù)正常或減低、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，部分患者出現(xiàn)肝酶、肌酶和肌紅蛋白增高。多數(shù)患者C反應(yīng)蛋白和血沉升高，降鈣素原正常。嚴(yán)重者D-D二聚體升高，淋巴細(xì)胞進(jìn)行性減少。

從組織病理學(xué)表現(xiàn)來(lái)看，患者表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎，肺泡腔大量的多核巨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡比彌漫性增厚，肺泡間隔增寬。

2. 研究目的和意義

利用SARS-CoV-2感染表達(dá)人SARS-CoV受體ACE2的轉(zhuǎn)基因小鼠，觀(guān)察并檢測(cè)感染后的臨床癥狀、病原學(xué)和病理學(xué)等指標(biāo)，獲得SARS-CoV-2感染引起肺炎發(fā)生、發(fā)展的動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型，滿(mǎn)足致病機(jī)制、疫苗和藥物評(píng)價(jià)、傳播途徑等研究對(duì)動(dòng)物模型的需求。

3. 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

2019年底，在中國(guó)湖北武漢華南海鮮市場(chǎng)爆發(fā)的新型冠狀病毒感染肺炎（COVID-19）疫情[1]，已經(jīng)波及全中國(guó)及其他許多國(guó)家，被世界衛(wèi)生組織定義為“國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”[2]。當(dāng)務(wù)之急是要找到預(yù)防和治療新型冠狀病毒的有效措施，因此，研究新型冠狀病毒在體內(nèi)的致病機(jī)制迫在眉睫。構(gòu)建新型冠狀病毒肺炎的動(dòng)物模型，不但為了解該疾病的致病性和病理?yè)p傷特征打下基礎(chǔ)，也是評(píng)價(jià)相關(guān)藥物和疫苗的有效性和安全性時(shí)，不可或缺的工具和科技支撐。

因?yàn)樾滦凸跔畈《荆⊿ARS-CoV-2）和嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）具有高度的同源性，而SARS病毒進(jìn)入人體的特異性受體為人血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（human Angiotensin-converting enzyme 2，hACE2）[3]。科研人員經(jīng)過(guò)大量的分子生物學(xué)分析表明，新型冠狀病毒很有可能利用同樣的受體hACE2入侵人體。因此，我們選擇hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠作為感染新型冠狀病毒的模型動(dòng)物，用以構(gòu)建SARS-CoV-2感染小鼠模型。